Преподобний Ніл Столобенський народився в другій половині XV століття в одному з селищ Деревської Пятини Жабенського цвинтаря в Новгородській землі (в деяких текстах житія Преподобного його батьківщиною називається саме селище Жабна — центр цвинтаря, або волості). Благочестиві батьки виховали його в страху Божому, в любові до молитви і читання душеполезних книг. Після їх смерті, близько 1505 року, Преподобний прийняв чернечий постриг з ім'ям на честь преподобного Ніла Синайського в обителі преподобного Сави Крипецького. Після прийняття чернецтва Святий Ніл мужньо озброївся проти внутрішніх пристрастей диявола.
З ретельністю виконуючи всі покладені на нього послуху, він беззаперечно корився ігумену. У всіх вчинках преподобний Ніл виявляв смиренність, лагідність і незлобивість. Приборкавши пристрасті, змиривши плоть постом і бдінням і омивши душу сльозами, він став обраним посудиною Святого Духа.
Щоб уникнути мирської слави, преподобний Ніл в 1515 році попросив благословення настоятеля і покинув Крипецький монастир для пустельництва. Покладаючись на вказівку Боже, Преподобний пройшов багато незаселених місць і нарешті, прийшовши в Ржевскую землю, обрав пустельне лісисте місце поблизу річки Серемхи (або Черемхи). Поставивши невелику келію, Святий віддався подвигам невпинної молитви і стриманості. Їжею служили жолуді та інші плоди лісу. Біси, щоб налякати святого і прогнати його з пустелі, були йому у вигляді лютих звірів і гадів. Вони з пронизливим свистом і шипінням спрямовувалися на нього, але святий подвижник відганяв їх молитвою і хресним знаменням. Не маючи можливості вигнати Преподобного з пустелі, біси навчали злих людей завдавати йому шкоди. Одного разу до Святого відлюдника прийшли розбійники, думаючи знайти у нього будь-які скарби. Дізнавшись про їх прихід, преподобний Ніл створив молитву і вийшов їм назустріч з іконою Божої Матері в руках. Розбійникам здалося, що з преподобним йде безліч озброєних людей. Вони злякалися і стали просити у святого вибачення. Святий Ніл з любов'ю прийняв їх покаяння і відпустив з миром.
Через 13 років, за влаштуванням Промислу Божого, ім'я преподобного Нілу стало відомо в багатьох навколишніх селищах. Багато стали приходити до нього за благословенням, настановами і порадами. Подвижницьке життя святого відлюдника викликала мирську хвалу, і це вкрай засмучувало смиренного ченця. У нічних молитвах він зі сльозами просив Пресвяту Богородицю наставити його на шлях відокремлених подвигів.
Одного разу в тонкому сні Преподобний почув веління йти на острів Столобний, розташований на озері Селігер. Переселення преподобного Нілу на цей пустельний острів відбулося в 1528 році. Першу зиму Святий прожив у викопаній ним в горі печері, а потім побудував невелику дерев'яну келію і каплицю. Ворог роду людського спробував вигнати святого і з цього місця, будучи йому і погрожуючи бідами. Він навчив і навколишніх поселян шкодити подвижнику. Нікому раніше не потрібний Острів раптом став необхідний жителям сусідніх з ним селищ, і вони вирішили вирубати на ньому ліс і розорати ріллю. Зрубаний же ліс підпалили, сподіваючись, що разом з ним згорить і келія святого. Але коли вогонь вирував по острову і наблизився до житла преподобного Нілу, по молитві святого полум'я згасло. Як і в Серемській пустелі, на преподобного Ніла напали розбійники, вимагаючи скарбів. Святий сказав їм, що його скарб знаходиться в кутку келії — там стояла ікона Божої Матері. Кинувшись туди, розбійники осліпли. Розкаявшись у злих задумах, вони по молитві святого прозріли.
Після тривалої і посиленої боротьби з пристрастями і дияволом преподобний Ніл удостоївся від Господа дару духовного прозріння і міркування. Завдяки повчанням Преподобного багато людей виправляли своє життя, за його молитвами вони отримували допомогу від Бога і розраду. За молитвами святого приборкувалися хвилі на Селігері і захоплені бурею рибалки рятувалися від смерті. 27 років прожив преподобний Ніл на Столобному, з великим терпінням переносячи всякі напасті, скорботи і позбавлення. Особливим подвигом святого Ніла було те, що він не лягав для сну, але спав сидячи, спершись на два великих дерев'яних гака, вбитих в стіну келії. За кілька років до смерті преподобний Ніл викопав в каплиці могилу і поставив в ній труну, до якого приходив кожен день і оплакував свої гріхи.
Преподобному Нілу було відкрито час його смерті — 7 грудня 1554 року. Незадовго перед тим святого відвідав його духівник-ігумен Раковського Миколаївського монастиря Сергій і причастив преподобного Нілу Святих Христових Тайн. Преподобний передбачив виникнення чернечої обителі на місці своїх подвигів. Перед блаженною кончиною він окадив келію, а потім мирно спочив сидячи, спершись на дерев'яні гаки. Коли прийшли братія Рожківської обителі, то в келії святого відчули пахощі, а лик покійного сяяв незвичайним світлом. Його поховали в приготованому ним гробі.
Після смерті преподобного Нілу на острів Столобний приходили ченці з різних монастирів, мандрували по святих місцях, і жили в його келії деякий час. Ігуменом Антонієм і ченцем Германом над могилою Преподобного була влаштована гробниця, у якій ще до заснування обителі відбувалися зцілення болящих. Близько 1590 року чернець Герман оселився на острові, де в той час жив мандрівник Борис Холмогорець. З благословення митрополита Новгородського Олександра (1576-1591) вони побудували дерев'яний храм на честь Богоявлення з боковим вівтарем в ім'я блаженного Василя, Христа ради юродивого, Московського Чудотворця (†1557; пам'ять 2 серпня).
Незабаром виникла обитель з общежітельним статутом, що отримала назву Нілової пустелі. Першим настоятелем її був ієромонах Герман.
У 1595 році ченці-іконописці Тверського Оршина Вознесенського монастиря Іов і Ніфонт написали образ преподобного Нілу, який був покладений на гробницю Преподобного. У 1598-1600 роках Філофей Пирогов, чернець Гефсиманського скиту Троїце-Сергієвого монастиря, склав стихири і канон святому і написав його житіє.
У 1665 році в монастирі сталася пожежа, згоріли всі дерев'яні будівлі, в тому числі і храм. Для здійснення богослужінь була побудована тимчасова дерев'яна церква, а 27 травня 1667 над гробницею преподобного Нілу був закладений новий кам'яний храм. Під час копання ровів для храму земля обсипалася, оголивши труну; таким чином були знайдені нетлінні і запашні мощі преподобного Нілу. З благословення митрополита Новгородського Питирима (на Новгородській кафедрі з 1664 по 1672, потім — Патріарх Всеросійський; † 1673) в цей день було встановлено щорічне святкування здобуття святих мощей преподобного Нілу. Чудотворні мощі його були перекладені в нову гробницю і поставлені в дерев'яному Покровському храмі. 30 жовтня 1669 в новому кам'яному храмі були освячені бокові вівтарі в ім'я святого апостола Іоанна Богослова і блаженного Василя, Христа ради юродивого. Святі мощі преподобного Нілу поставили в першому вівтарі, а 9 квітня 1671 перенесли їх в головний Богоявленський храм (після його освячення). З 17 травня 1756 року щорічно стало відбуватися урочисте обнесення святих мощей навколо монастиря, пізніше — хресний хід з міста Осташкова. Зберігся опис численних зцілень, що відбулися біля гробниці преподобного Нілу по його святим молитвам. Нині святі мощі преподобного Нілу спочивають у Богоявленському соборі Ніло-Столобенської пустелі.